Como Usar o Side Scatter do laser Violeta para Detectar Nanopartículas no Citômetro de Fluxo CytoFLEX

Autores:
George C. Brittain, Ph.D.
Sergei Gulnik, Ph.D.

Afiliação: 
Beckman Coulter Life Sciences, Miami, FL 33196

Neste artigo você aprenderá a

  • Testar empiricamente o threshold para detecção de nanopartículas em seu citômetro de fluxo
  • A habilidade de detectar pequenas partículas está diretamente correlacionada ao comprimento de onda de luz usado para detecção
  • O uso do side scatter violeta no CytoFLEX permite a detecção e resolução de nanopartículas

Histórico

A detecção de micropartículas por citometria de fluxo fica mais difícil conforme o tamanho das partículas fica cada vez menor do que o comprimento de onda de luz utilizada para detectá-las. A detecção padrão dessas micropartículas por Forward Scatter é problemática porque elas têm uma menor dispersão devido a uma menor área transversal, e há uma crescente tendência para refração isotrópica de luz ortogonalmente polarizada com tamanhos de partículas decrescentes (Hielscher et al., 1997).

Enquanto estas propriedades prejudicam a resolução de micropartículas por conta do ruído de fundo do forward scatter; o side scatter realmente melhora sua detecção e resolução. Ao utilizar o side scatter para detectar partículas pequenas, uma variedade de fatores pode influenciar sua detecção, tais como diferenças entre os índices de refração das partículas e seu meio circundante, e a complexidade interna das partículas detectadas. Em geral, quanto maior a diferença nos índices de refração, mais luz será dispersada pelas partículas; e, quanto mais granular for a composição das partículas (isto é, vesículas intracelulares, agregados de proteína, íons metálicos etc.), mais luz será dispersada pelos componentes das micropartículas. Além disso, a quantidade de luz dispersada por qualquer partícula é diretamente proporcional ao diâmetro da partícula e inversamente proporcional ao comprimento de onda  usado para detectá-la.

Esta relação pode ser vista nas equações tanto para a Teoria de Mie quanto para a Dispersão de Luz de Raleigh, que são usadas para calcular a dispersão de luz  por partículas de tamanho similar ou muito menores do que o comprimento de onda usado para detectá-las, respectivamente (Bohren e Huffmann, 2010). Por este motivo, o menor comprimento de onda do laser violeta (405 nm) resultará em dispersão de luz mais ortogonal em um dado tamanho de partícula comparado ao comprimento de onda do laser azul (488 nm), e aumentará a resolução para partículas menores do que pode ser detectado pelo side scatter padrão – (488nm). Mais ainda,  em um meio de índice de refração diferente, as ondas de luz são refratadas pelo novo meio inversamente proporcional ao comprimento de onda; e os comprimentos de onda menores tendo uma maior refração do que comprimentos de onda maiores. Este efeito foi descoberto por Isaac Newton quando dividiu a luz branca em um arco íris de cores individuais usando um prisma, com a luz vermelha refratando o mínimo e a luz violeta refratando o máximo (Figura 1) (Newton, 1704).

Com base nesta propriedade física, o uso de luz violeta ajudará a amplificar as diferenças nos índices de refração entre as partículas e seu meio circundante, e por outro lado aumenta a capacidade de detectar partículas com menor índice de refração, tais como exossomos, microvesículas e nanopartículas de sílica. A finalidade deste artigo é demonstrar como ajustar o citômetro de fluxo CytoFLEX para detectar micropartículas utilizando o side scatter do laser Violeta (V-SSC). Para considerações práticas importantes para a análise de micropartículas por citometria de fluxo, por favor, consulte as publicações referentes ao tema (Nolan, 2015; Poncelet et al., 2015; Arraud et al., 2015).

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